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MeisenCTCC-干细胞诱导成骨步骤

间充质干细胞(MSC, mesenchymal stem cells)是干细胞家族的重要成员,来源于发育早期的中胚层,属于多能干细胞间充质干细胞在体内或体外特定的诱导条件下,可分化为脂肪、骨、软骨、肌肉、肌腱、韧带、神经、肝、心肌、内皮等多种组织细胞,连续传代培养和冷冻保存后仍具有多向分化潜能,可作为理想的种子细胞用于衰老和病变引起的组织器官损伤修复


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成骨诱导分化步骤



1.成骨诱导分化完全培养基的配制室温条件下融化各因子及血清。各因子融化后,瞬时离心,使溶液集中于离心管底 部。(注意:若因子或血清中有沉淀物,属正常现象,无须过滤,避免成分丢失。) 根据实验用量,于无菌操作台中配制诱导分化完全培养基,建议每次配制50mL, 配制比例见下表:



2.成骨诱导分化实验步骤①建议取第3~5代、纯度达90%以上、状态良好的间充质干细胞,将其消化下来,离心 收集,使用间充质干细胞完全培养基调整细胞密度为1~5×105cell/mL,均匀铺于孔板中,每孔2mL,置于37℃恒温细胞培养箱中培养。(注意:此处细胞密度及培养液 体积以6孔板为例,若为其它培养器皿,请根据实际情况调整细胞密度及培养液体积。) ②待细胞汇合度达80%~100%时,即可进行诱导分化。③小心吸弃细胞培养上清,沿孔壁缓慢加入提前配制好的诱导分化完全培养基,每孔 2mL,置于37℃恒温细胞培养箱中培养。(注意:完全培养基加入细胞前需提前置于37℃ 预热。) ③每2day换用新鲜的诱导分化完全培养基。换液时,若细胞培养上清颜色变为澄清的 黄色,是由于细胞量较大,营养消耗较快导致的,请及时调整为每日换液。(注意:完全培养基加入细胞前需提前置于37℃预热。) ④细胞诱导3周后,即可进行茜素红染色鉴定。                       
3.茜素红染色分析 细胞诱导分化结束后,小心吸弃细胞培养上清,1×PBS润洗1~2次。每孔加入1mL 细胞固定液(4%中性甲醛溶液等),室温固定30 min吸弃细胞固定液,1×PBS润洗2次。沿孔壁缓慢加入茜素红染色液,每孔1mL,室 温染色30min(注意:染色液底部可能会有沉淀,吸取时尽量不要触及底部。若细胞染色 后有沉淀,1×PBS洗去即可。) 吸出染色液,1×PBS润洗,去掉浮色。显微镜下观察细胞染色效果,钙盐呈较深 的橙红色。(注意:染色液可重复使用,建议收集。) 


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