1）从液氮中取出冻存管时，往往在冻存管里含有液氮，最好先将冻存管先置于超低温冰箱中，
使液氮挥发，再进行水浴化冻的操作；
2）尽可能将冻存管的内含物全部浸没于 37°C 温水中，使内含物均匀融化；
3) 请勿使温水没过冻存管盖的螺口，以防污染；
4) 细胞复苏的操作过程要迅速，避免影响细胞复苏后的活性。
4 在将冻存管拿进生物安全柜之前，用 75%酒精对其表面进行消毒；
5 轻轻重悬细胞，并将其移入装有 300μg DNase I 的 50mL 离心管里；
注意：
1）加入 DNase I 可有效减少中性粒细胞复苏后细胞团块的产生；
2）DNase I 的使用是非必须的，对于 DNA, RNA 等的提取目的可不使用。
6 用 1mL 培养基冲洗冻存管，并将此悬液以 3-5s 每滴的速度滴加到 50mL 离心管中，并且同时
轻轻摇晃离心管，使滴加的悬液混匀；
7 吸取 15-20mL 的培养基以 3-5s 每滴的速度滴加到 50mL 离心管中，并且同时轻轻摇晃离心管，
使滴加的悬液混匀；
注意：第 5,6,7 步骤可使中性粒细胞中的 DMSO 缓慢均匀的渗透出来，最大程度保证细胞安全，
但操作较为缓慢，若有多个样品需要处理时，可以将操作步骤更改为：
5’：轻轻重悬细胞，并将其移入装有 300μg DNase I 的 15mL 离心管里；
6’：用 1mL 培养基冲洗冻存管，并将此悬液合并到到 15mL 离心管里；
7’：吸取 10mL 培养基，直接加入到 15mL 离心管中，反复轻柔吹打或上下颠倒混匀，室温
孵育 10min；
8 室温下，300g 离心 10min；
9 迅速使用移液枪吸走上清，剩余少许液体，并轻轻吹打液体使 PBMC 悬浮；
注意：
1）离心结束后，尽快吸走上清；
2) 吹打液体时动作要轻，避免损伤细胞，并且吹打时尽可能避免气泡产生。第 3 页 共 3 页
10 缓慢加入 15-20mL 新鲜培养基，并同时轻轻摇晃离心管；
11 室温下，300g 离心 10min；
12 迅速使用移液枪吸走上清，剩余少许液体，并轻轻吹打液体使细胞悬浮，此中性粒细胞即可
用于下游实验
